霍乱诊断标准及处理原则GB 15984-199

  附录 B
　　　　　　　　　　　　　　　血清学检查
　　　　　　　　　　　　　　　　 ( 参考件 )
　　
B1 血清学检查有助于流行病学追溯诊断，检查抗体的成分为抗菌抗体。为进行血清学诊断，需要采取病人的双份血清，在发病第 1 ～ 3 天采第一份血清，第 15 ～ 20 天采第二份血清。检查血清中抗菌抗体常用凝集试验和杀弧菌试验，杀弧菌试验比凝集试验敏感。
B2 试管凝集试验：用生理盐水对倍连续稀释待检血清，每管含稀释血清 0.5mL 。将标准菌在营养琼脂上的 16 ～ 18h 培养物用 0.2 ％福尔马林生理盐水制成约含 18 亿菌 /mL( 相当于细菌标准比浊管浓度 ) 的悬液，每稀释血清管加 0.5mL ；另将菌悬液加入 0.5mL 生理盐水中作对照。摇匀，置 37C 3h 观察初步结果，再放冰箱 ( 4 ℃ ) 或室温过夜，观察最后结果。生理盐水对照不出现自然凝集，能使菌凝于管底成伞状，上清半透明者判为＋＋，以能使菌呈＋＋凝集的血清最高稀释度判为血清凝集效价。第二份血清效价比第一份血清增长 4 倍或以上者有诊断意义。
B3 杀弧菌抗体检测：可采用改良微量法，检测程序如下：
a.2 ， 3 ， 5 －氯化三苯四氮唑溶液 (TTC) 的配制：用无菌蒸馏水配制 0.5 ％ (W/V) 溶液，加热溶解，置灭菌棕色瓶中， 4 ℃ 保存备用。
b. 补体指示菌混悬液制备：选取标准 01 群及 0139 群霍乱弧菌为指示菌，分别连续在营养琼脂平板上分离 2 次，选取光滑型菌落 2 ～ 3 个，挑取小量接种于 5mL 营养肉汤中， 37 ℃ 培养 6h ，取 0.1mL 转种于 5mL 营养肉汤， 37 ℃ 培养 2h ，用分光光度计测定 492nm 吸光度 (OD) 值，调整 OD 值至 0.1 为原液。将原液作 1 ∶ 50 稀释后与 1 ∶ 10 补体等量混合，即为补体指示菌混悬液。
c. 待检血清稀释：于经洗涤处理、无水乙醇浸泡 5min 和紫外灯照射灭菌 1h 的微量培养板或 4 × 10 孔聚苯乙烯塑料板用微量加液滴管每孔加入一滴 (0.025mL) 灭菌磷酸盐缓冲盐水 PBS 或生理盐水，再将待测灭活血清一滴 (0.025mL) 加入每排的第 1 孔，自第 1 孔开始作连续对倍稀释至第 10 孔。
d. 加补体指示菌悬液：于每孔稀释血清加入补体指示菌悬液一滴，加盖，在微型振荡器上振荡 1 ～ 2min ，置 37 ℃ 水浴箱孵育 30min 。
e. 加 TTC 营养肉汤：每孔加入含 0.01 ％ TTC 的营养肉汤 0.15mL(2 大滴 ) ，混匀后，继续置 37 ℃ 水浴箱孵育 4h 。
f. 观察结果：以孔内无颜色变化的血清最高稀释度为被检测标本的杀弧菌抗体滴度，第二份血清效价比第一份血清升高 8 倍或以上者有诊断意义。
　　
　　　　　　　　　　　　　　　附录 C
　　　　　　　　　　　 01 群霍乱弧菌的鉴定和分型
　　　　　　　　　　　　　　 ( 参考件 )
　　
C1 血清分型
用普通琼脂或碱性琼脂培养基上的菌苔进行血清分型。分型使用小川型及稻叶型的单价血清作玻片凝集反应。
C1.1 在小川型单价血清凝集，在稻叶型单价血清不凝集者为小川型。
C1.2 在小川型单价血清不凝集，在稻叶型单价血清凝集者为稻叶型。
C1.3 在小川型、稻叶型单价血清均呈明显凝集者为彦岛型。
C2 试管凝集试验
用生理盐水自 1 ∶ 20 开始对倍连续稀释 01 群霍乱多价血清，每管含稀释血清 0.5mL 。将被检菌在营养琼脂的 16 ～ 18h 培养物用 0.2 ％福尔马林生理盐水制成每毫升约含 18 亿菌体 ( 相当于细菌标准比浊管浓度 ) 的悬液，每稀释血清管加入 0.5mL ；另将菌悬液 0.5mL 加入 0.5mL 生理盐水中作对照。摇匀，置 37 ℃ 3h 观察初步结果。再放 4 ℃ 或室温过夜，观察最后结果。生理盐水对照不出现自然凝集，能使试验菌出现＋＋凝集的血清最高稀释倍数为凝集滴度，凝集滴度达到或超过血清原效价一半的即可确定为 01 群霍乱弧菌。
对一次流行的首批病例菌株和玻片凝集反应不典型的菌株应做本试验。
C3 古典型和埃尔托型的鉴别
C3.1 按表 C1 所列的试验鉴别 01 群霍乱弧菌的两个生物型。
　　表 C1 　 01 群霍乱弧菌两个生物型的鉴别
　　
　　注：括弧内为少数菌株结果。
C3.2 　试验方法：
a. 第Ⅳ组霍乱噬菌体裂解试验：
本项试验与噬菌体分型在同一平皿上进行，方法见 C 4.1.2 。
b. 多粘菌素 B 敏感试验：将 1.5 ％普通琼脂加热溶化，待冷却至 50 ℃ 左右，按每毫升培养基加入 50 单位多粘菌素 B ，摇匀后倾注平皿，凝固后备用。在平皿背面用玻璃笔划出若干方格。将被检菌 2 ～ 3h 肉汤培养物一接种环点在培养基表面，待干后放 37 ℃ 培养过夜，观察结果。被检菌不生长或生长不足 10 个菌落为敏感，记录为＋号。
c. 鸡血球凝集试验：在清洁平皿内划出方格，用直径 4mm 的接种环取一滴生理盐水滴在每个方格内，取被检菌 18h 琼脂培养物少许，在生理盐水中制成浓厚菌悬液。再用接种环各加一滴经洗涤三次的 2.5 ％鸡血球生理盐水悬液，充分摇匀，肉眼观察结果。 1min 内出现血球凝集者为阳性，血球呈均匀分散状态者为阴性。埃尔托型为阳性，古典型一般为阴性。
d.V － P 试验：将被检菌接种于葡萄糖磷酸盐蛋白胨水， 37 ℃ 培养 2 ～ 3 天。然后取出 1mL 培养物加 5 ％α－萘酚乙醇溶液 0.6mL ，振荡 5s ，加入 40 ％氢氧化钾液 0.2mL ，再振荡 5s ，去掉棉塞置室温。在 1h 内出现红色反应者为阳性。阴性者在试剂加入后逐渐出现浅褐色。古典型为阴性，而埃尔托型多为阳性。
e. 溶血试验：取被检菌 24h 普通肉汤 ( 中试管装 8 ～ 10mL) 培养物 1mL ， 1 ％绵羊红血球 ( 生理盐水洗 3 次，最后 1 次离心速度为 2000r/min ，离心 10min)1mL ，混匀后放 37 ℃ ， 2h 观察初步结果，再放 4 ℃ 冰箱过夜观察最后结果。试验应有已知溶血株、不溶血株和肉汤管做对照。达半数血球溶解者为溶血阳性。为证明为不耐热溶血素，可将被检菌的培养物加热 56 ℃ 30min 后再做溶血试验。古典型不产生可溶性溶血素，埃尔托型有些产生，有些不产生不耐热的可溶性溶血素。
C4 噬菌体－生物分型
C4.1 噬菌体分型
C4.1.1 利用五株国内分离的弧菌噬菌体 (VP1 ～ VP5) 将埃尔托型霍乱弧菌分成 32 个噬菌体型 ( 表 C2) 。
　　表 C2 　埃尔托型霍乱弧菌噬菌体分型表
　　
　　续表 C 2
　　
C4.1.2 噬菌体分型方法：在 1.5 ％普通琼脂平皿的背面，用玻璃笔划出 9 个方格，再将被检菌 2 ～ 3h 肉汤培养物 0.2mL 加至已融化并冷至 50 ℃ 的 0.7 ％ 4mL 半固体琼脂中，混匀后倾注于琼脂平皿上。待干后，于第 1 ～ 5 格分别滴加 VP1 ～ VP5 分型噬菌体的原液 (108 ～ 109/mL) 第 6 、 7 格分别滴加第Ⅳ组霍乱噬菌体原液 (109/mL) 及常规稀释液 (106/mL) ；第 8 、 9 格滴埃尔托型霍乱弧菌的溶原噬菌体两个代表株 ( 溶原性菌株的 18 ～ 20h 肉汤培养物，经 56 ℃ 30min 水浴杀菌后使用 ) ，作为对溶原噬菌体敏感性的测定。待干后放 37 ℃ 培养过夜，观察结果。依据被检菌对 VP1 ～ VP5 噬菌体的敏感性，按表 C2 判定其噬菌体型别。
C4.2 埃尔托型霍乱弧菌的生物分型
C4.2.1 根据菌株的溶原性、对溶原噬菌体的敏感性、山梨醇发酵试验和溶血试验等四个生物学性状，将埃尔托型霍乱弧菌分成 12 个生物型 ( 表 C3) 。
　　表 C3 　埃尔托型霍乱弧菌生物分型表
　　
C4.2.2 溶原性测定：从埃尔托型霍乱弧菌复愈型抗链霉素株 SM6 的普通琼脂平皿培养物上挑取光滑圆整的典型菌落接种普通肉汤， 37 ℃ 培养 8 ～ 12h ，作为指示菌。
在直径 9cm 平皿中倾注一薄层 1.5 ％普通琼脂培养基，待凝固后，于平皿底的背面用玻璃笔划出 16 ～ 20 个方格，并注明被检菌号。
将 4mL0.7 ％普通半固体琼脂培养基加热融化，待冷至 50 ℃ 加入链霉素 2000 单位及指示菌 0.3mL ，混匀，倾注于上述已凝固的琼脂平皿底层上。待凝结后，将被检菌的 18 ～ 24h 肉汤培养物，用接种环分别滴加在指示菌平皿的每个小格内，待干后放 37 ℃ 培养过夜。出现不透明的磨玻璃样噬斑或裂解区，边缘有明显的、窄的、不圆整的裂解环者为阳性。
C4.2.3 对溶原噬菌体敏感性的测定：在噬菌体分型的平皿上，滴加埃尔托溶原噬菌体代表株 ( 溶原性菌株的 18 ～ 20h 肉汤培养物，经 56 ℃ 30min 水浴杀菌后使用 ) 37 ℃ 培养过夜后观察结果。出现不透明噬斑者为阳性，表明被检菌株对溶原噬菌体敏感，即为复愈型菌株，不出现噬斑者可能是溶原株，也可能是非溶原株。
C4.2.4 山梨醇发酵试验：将 0.1g 蛋白胨与 0.5g 氯化钠加于 100mL 蒸馏水中加热溶解。调整 pH8.0 或 9.0 之后，加 0.25 ％酚红指示剂 1mL 和山梨醇 2.0g ，溶解后分装小试管，每管 3mL ， 0.06MPa 高压蒸汽灭菌 20min 。